BDDE හරස්-සම්බන්ධිත ස්වයංක්‍රීය ක්ලේව් හි නව ප්‍රතික්‍රියා අතුරු නිෂ්පාදන හඳුනා ගැනීම

Javascript දැනට ඔබගේ බ්‍රවුසරයේ අබල කර ඇත.ජාවාස්ක්‍රිප්ට් අක්‍රිය කළ විට, මෙම වෙබ් අඩවියේ සමහර කාර්යයන් ක්‍රියා නොකරනු ඇත.
Javier Fidalgo, * Pierre-Antoine Deglesne, * Rodrigo Arroyo, * Lilian Sepúlveda, * Evgeniya Ranneva, Philippe Deprez Department of Science, Skin Tech Pharma Group, Castello D'Empúries, Catalonia, Spain * මෙම කතුවරුන්ට මෙම කෘතීන් කිහිපයක් තිබේ. දායකත්වය පසුබිම: හයුලූරොනික් අම්ලය (HA) යනු සෞන්දර්යාත්මක අරමුණු සඳහා චර්ම පිරවුම් නිෂ්පාදනය සඳහා භාවිතා කරන ස්වභාවිකව පවතින පොලිසැකරයිඩයකි.එය මිනිස් පටක වල දින කිහිපයක අර්ධ ආයු කාලයක් ඇති බැවින්, HA මත පදනම් වූ චර්ම පිරවුම් ශරීරයේ ආයු කාලය දීර්ඝ කිරීම සඳහා රසායනිකව වෙනස් කර ඇත.වාණිජ HA-පාදක පිරවුම් වල වඩාත් සුලභ වෙනස් කිරීම වන්නේ HA දාම හරස් සම්බන්ධ කිරීම සඳහා හරස් සම්බන්ධක කාරකයක් ලෙස 1,4-බියුටෙනඩියෝල් ඩිග්ලිසිඩයිල් ඊතර් (BDDE) භාවිතා කිරීමයි.අවශේෂ හෝ ප්‍රතික්‍රියා නොකළ BDDE විෂ නොවන ලෙස සැලකේ <2 කොටස් මිලියනයකට (ppm);එබැවින්, අවසාන චර්ම පිරවුමේ ඉතිරිව ඇති BDDE රෝගියාගේ ආරක්ෂාව සහතික කිරීම සඳහා ප්‍රමාණ කළ යුතුය.ද්‍රව්‍ය සහ ක්‍රම: ද්‍රව වර්ණදේහ සහ ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය (LC-MS) ඒකාබද්ධ කිරීමෙන් ක්ෂාරීය තත්ව යටතේ BDDE සහ HA අතර හරස් සම්බන්ධක ප්‍රතික්‍රියාවේ අතුරු ඵලයක් හඳුනා ගැනීම සහ ගුනාංගීකරනය කිරීම මෙම අධ්‍යයනය විස්තර කරයි.ප්‍රතිඵල: විවිධ විශ්ලේෂණවලින් පසුව, HA-BDDE හයිඩ්‍රොජෙල් විෂබීජහරණය කිරීමට භාවිතා කරන ක්ෂාරීය තත්ත්වයන් සහ අධික උෂ්ණත්වය මෙම නව අතුරු නිෂ්පාදනයක් වන “ප්‍රොපිලීන් ග්ලයිකෝල් වැනි” සංයෝගය සෑදීම ප්‍රවර්ධනය කළ බව සොයා ගන්නා ලදී.LC-MS විශ්ලේෂණය මගින් අතුරු නිෂ්පාදනයට BDDE හා සමාන මොනොයිසොටොපික් ස්කන්ධයක්, වෙනස් රඳවා ගැනීමේ කාලයක් (tR) සහ වෙනස් UV අවශෝෂණය (λ=200 nm) මාදිලියක් ඇති බව තහවුරු විය.BDDE මෙන් නොව, LC-MS විශ්ලේෂණයේ දී එම මිනුම් තත්ව යටතේ මෙම අතුරු නිෂ්පාදනයට 200 nm හි වැඩි හඳුනාගැනීමේ වේගයක් ඇති බව නිරීක්ෂණය විය.නිගමනය: මෙම ප්රතිඵලවලින් පෙන්නුම් කරන්නේ මෙම නව සංයෝගයේ ව්යුහයේ ඉපොක්සයිඩ් නොමැති බවයි.වාණිජමය අරමුණු සඳහා HA-BDDE හයිඩ්‍රොජෙල් (HA ඩර්මල් ෆිලර්) නිෂ්පාදනයේදී සොයාගත් මෙම නව අතුරු නිෂ්පාදනයේ අවදානම තක්සේරු කිරීමට සාකච්ඡාව විවෘතය.මූල පද: හයුලූරොනික් අම්ලය, එච්ඒ ඩර්මල් ෆිලර්, හරස්-සම්බන්ධිත හයුලූරොනික් අම්ලය, BDDE, LC-MS විශ්ලේෂණය, BDDE අතුරු නිෂ්පාදන.
හයුලූරොනික් අම්ලය (HA) මත පදනම් වූ පිරවුම් යනු රූපලාවණ්‍ය අරමුණු සඳහා භාවිතා කරන වඩාත් සුලභ සහ ජනප්‍රිය චර්ම පිරවුම් වේ.1 මෙම චර්ම පිරවුම හයිඩ්‍රොජෙල් වන අතර, සාමාන්‍යයෙන් >95% ජලය සහ 0.5-3% HA වලින් සමන්විත වන අතර එමඟින් ඒවාට ජෙල් වැනි ව්‍යුහයක් ලබා දේ.2 HA යනු පොලිසැකරයිඩයක් වන අතර පෘෂ්ඨවංශීන්ගේ බාහිර සෛලීය අනුකෘතියේ ප්‍රධාන අංගය වේ.අමුද්රව්ය වලින් එකක්.එය සමන්විත වන්නේ (1,4) -glucuronic acid-β (1,3)-N-acetylglucosamine (GlcNAc) ග්ලයිකෝසයිඩ් බන්ධන මගින් සම්බන්ධිත ඩයිසැකරයිඩ ඒකක පුනරාවර්තනය වේ.මෙම ඩයිසැකරයිඩ රටාව සියලු ජීවීන් තුළ සමාන වේ.සමහර ප්‍රෝටීන් මත පදනම් වූ පිරවුම් (කොලජන් වැනි) සමඟ සසඳන විට, මෙම ගුණය HA ඉහළ ජෛව අනුකූල අණුවක් බවට පත් කරයි.මෙම පිරවුම් වලට රෝගියාගේ ප්‍රතිශක්තිකරණ පද්ධතිය මගින් හඳුනාගත හැකි ඇමයිනෝ අම්ල අනුක්‍රමික විශේෂත්වය ප්‍රදර්ශනය කළ හැක.
චර්ම පිරවුමක් ලෙස භාවිතා කරන විට, HA හි ප්‍රධාන සීමාව වන්නේ hyaluronidases නම් විශේෂිත එන්සයිම පවුලක් තිබීම නිසා පටක තුල එහි වේගවත් පිරිවැටුමයි.පටකවල HA හි අර්ධ ආයු කාලය වැඩි කිරීම සඳහා HA ව්‍යුහයේ රසායනික වෙනස් කිරීම් කිහිපයක් මෙතෙක් විස්තර කර ඇත.3 මෙම වෙනස් කිරීම් වලින් බොහොමයක් HA දාම හරස් සම්බන්ධ කිරීම මගින් පොලිසැකරයිඩ බහු අවයවක වෙත hyaluronidase ප්‍රවේශය අඩු කිරීමට උත්සාහ කරයි.එබැවින්, පාලම් සෑදීම සහ HA ව්‍යුහය සහ හරස් සම්බන්ධක කාරකය අතර අන්තර් අණුක සහසංයුජ බන්ධන හේතුවෙන්, හරස්-සම්බන්ධිත HA හයිඩ්‍රොජෙල් ස්වභාවික HA වලට වඩා වැඩි ප්‍රති-එන්සයිම හායන නිෂ්පාදන නිපදවයි.4-6
මෙතෙක්, හරස් සම්බන්ධිත HA නිෂ්පාදනය සඳහා භාවිතා කරන රසායනික හරස් සම්බන්ධක කාරකයන් අතරට මෙතක්‍රයිලමයිඩ්, 7 හයිඩ්‍රසයිඩ්, 8 කාබෝඩයිමයිඩ්, 9 ඩිවිනයිල් සල්ෆෝන්, 1,4-බියුටනේඩියල් ඩිග්ලිසිඩයිල් ඊතර් (BDDE) සහ පොලි(එතිලීන් ග්ලයිකෝල්) ඩිග්ලිසයිඩයිල් ඊතර් ඇතුළත් වේ.10 ,11 BDDE දැනට බහුලව භාවිතා වන හරස් සම්බන්ධක නියෝජිතයා වේ.මෙම හයිඩ්‍රොජෙල් වර්ග දශක ගණනාවක් තිස්සේ ආරක්ෂිත බව ඔප්පු වී ඇතත්, භාවිතා කරන හරස් සම්බන්ධක කාරකයන් සයිටොටොක්සික් සහ සමහර අවස්ථාවල විකෘති විය හැකි ප්‍රතික්‍රියාකාරක ප්‍රතික්‍රියාකාරක වේ.12 එබැවින්, අවසාන හයිඩ්‍රොජෙල්හි ඒවායේ අවශේෂ අන්තර්ගතය ඉහළ විය යුතුය.අවශේෂ සාන්ද්‍රණය මිලියනයකට කොටස් 2කට වඩා අඩු (ppm) විට BDDE ආරක්ෂිත යැයි සැලකේ.4
අඩු අවශේෂ BDDE සාන්ද්‍රණය, හරස් සම්බන්ධක උපාධිය සහ HA හයිඩ්‍රොජෙල්වල ආදේශන ස්ථානය හඳුනා ගැනීමට ක්‍රම කිහිපයක් තිබේ, එනම් ගෑස් වර්ණදේව, ප්‍රමාණය බැහැර කිරීමේ වර්ණ විද්‍යාව සහ ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය (MS), න්‍යෂ්ටික චුම්භක අනුනාද (NMR) ප්‍රතිදීප්ත මිනුම් ක්‍රම සහ Diode array coupled high performance liquid chromatography (HPLC).13-17 මෙම අධ්‍යයනය මගින් ක්ෂාරීය තත්ත්‍වයන් යටතේ BDDE සහ HA ප්‍රතික්‍රියාව මගින් නිපදවන අවසාන හරස් සම්බන්ධිත HA හයිඩ්‍රොජෙල් හි අතුරු නිෂ්පාදනයක් හඳුනා ගැනීම සහ ගුනාංගීකරනය විස්තර කරයි.HPLC සහ ද්රව වර්ණදේහ-ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය (LC-MS විශ්ලේෂණය).BDDE හි මෙම අතුරු නිෂ්පාදනයේ විෂ සහිත බව නොදන්නා බැවින්, එහි අපද්‍රව්‍ය ප්‍රමාණනය සාමාන්‍යයෙන් අවසාන නිෂ්පාදනයේ BDDE හි සිදු කරන ක්‍රමයට සමාන ආකාරයකින් තීරණය කළ යුතු බව අපි නිර්දේශ කරමු.
HA (Shiseido Co., Ltd., Tokyo, Japan) හි ලබාගත් සෝඩියම් ලුණු අණුක බර ~1,368,000 Da (Laurent method) 18 සහ සහජ දුස්ස්රාවිතතාවය 2.20 m3/kg වේ.හරස් සම්බන්ධක ප්‍රතික්‍රියාව සඳහා, BDDE (≥95%) Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) වෙතින් මිලදී ගන්නා ලදී.PH 7.4 සහිත පොස්පේට් බෆරඩ් සේලයින් සිග්මා-ඇල්ඩ්‍රිච් සමාගමෙන් මිලදී ගන්නා ලදී.LC-MS විශ්ලේෂණයේදී භාවිතා කරන සියලුම ද්‍රාවක, ඇසිටොනයිට්‍රයිල් සහ ජලය HPLC ශ්‍රේණියේ ගුණාත්මක භාවයෙන් මිලදී ගන්නා ලදී.ෆෝමික් අම්ලය (98%) ප්‍රතික්‍රියාකාරක ශ්‍රේණියක් ලෙස මිලදී ගනු ලැබේ.
සියලුම අත්හදා බැලීම් UPLC Acquity පද්ධතියක් (Waters, Milford, MA, USA) මත සිදු කරන ලද අතර විද්‍යුත් ඉසින අයනීකරණ ප්‍රභවයකින් (AB SCIEX, Framingham, MA, USA) සමන්විත API 3000 ත්‍රිත්ව චතුරස්‍ර ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂයකට සම්බන්ධ කරන ලදී.
හරස්-සම්බන්ධිත HA හයිඩ්‍රොජෙල් සංශ්ලේෂණය ආරම්භ කරන ලද්දේ 1% ක්ෂාර (සෝඩියම් හයිඩ්‍රොක්සයිඩ්, NaOH) හමුවේ 10% (w/w) සෝඩියම් හයුලුරොනේට් (NaHA) ද්‍රාවණයකට BDDE මිලිග්‍රෑම් 198 ක් එකතු කිරීමෙනි.ප්‍රතික්‍රියා මිශ්‍රණයේ අවසාන BDDE සාන්ද්‍රණය 9.9 mg/mL (0.049 mM) විය.ඉන්පසුව, ප්රතික්රියා මිශ්රණය තරයේ මිශ්ර කර සමජාතීය කර පැය 4 ක් සඳහා 45 ° C දී ඉදිරියට යාමට ඉඩ ලබා දේ.19 ප්‍රතික්‍රියාවේ pH අගය ~12 ලෙස පවත්වා ගනී.
ඉන්පසුව, ප්‍රතික්‍රියා මිශ්‍රණය ජලයෙන් සෝදා, අවසාන HA-BDDE හයිඩ්‍රොජෙල් පෙරීම සහ PBS බෆරය සමඟ තනුක කර 10 සිට 25 mg/mL දක්වා HA සාන්ද්‍රණයක් සහ අවසාන pH අගය 7.4ක් ලබා ගන්නා ලදී.නිපදවන ලද හරස්-සම්බන්ධිත HA හයිඩ්‍රොජෙල් විෂබීජහරණය කිරීම සඳහා, මෙම සියලුම හයිඩ්‍රොජෙල් ස්වයංක්‍රීයව (විනාඩි 20 ක් සඳහා 120 ° C) වේ.පිරිසිදු කරන ලද BDDE-HA හයිඩ්‍රොජෙල් විශ්ලේෂණය වන තෙක් 4 ° C දී ගබඩා කර ඇත.
හරස්-සම්බන්ධිත HA නිෂ්පාදනයේ ඇති BDDE විශ්ලේෂණය කිරීම සඳහා, 240 mg සාම්පලයක් කිරා මැන මධ්‍ය කුහරය තුළට හඳුන්වා දෙන ලදී (Microcon®; Merck Millipore, Billerica, MA, USA; පරිමාව 0.5 mL) සහ කාමර උෂ්ණත්වයේ දී 10,000 rpm දී කේන්ද්‍රාපසාරී කරන ලදී. විනාඩි 10 යි.පුල්-ඩවුන් දියර 20 µL එකතු කර විශ්ලේෂණය කරන ලදී.
ක්ෂාරීය තත්ව යටතේ (1%, 0.1% සහ 0.01% NaOH) BDDE ප්‍රමිතිය (Sigma-Aldrich Co) විශ්ලේෂණය කිරීම සඳහා, පහත සඳහන් කොන්දේසි සපුරා ඇත්නම්, දියර නියැදිය 1:10, 1:100, හෝ දක්වා වේ. 1:1,000,000 අවශ්ය නම්, විශ්ලේෂණය සඳහා MilliQ deionized ජලය භාවිතා කරන්න.
හරස් සම්බන්ධක ප්‍රතික්‍රියාවේ (HA 2%, H2O, 1% NaOH, සහ 0.049 mM BDDE) භාවිතා කරන ආරම්භක ද්‍රව්‍ය සඳහා, මෙම ද්‍රව්‍ය වලින් සකස් කරන ලද එක් එක් නියැදියෙන් 1 mL එකම විශ්ලේෂණ කොන්දේසි භාවිතා කරමින් විශ්ලේෂණය කරන ලදී.
අයන සිතියමේ දිස්වන උච්ච වල විශේෂත්වය තීරණය කිරීම සඳහා, 20 µL නියැදියට 10 µL 100 ppb BDDE සම්මත ද්‍රාවණය (Sigma-Aldrich Co) එකතු කරන ලදී.මෙම අවස්ථාවෙහිදී, එක් එක් සාම්පලයේ සම්මතයේ අවසාන සාන්ද්රණය 37 ppb වේ.
පළමුව, 990 μL MilliQ ජලය (ඝනත්වය 1.1 g/mL) සමඟ සම්මත BDDE (Sigma-Aldrich Co) 10 μL තනුක කිරීමෙන් 11,000 mg/L (11,000 ppm) සාන්ද්‍රණයක් සහිත BDDE කොටස් ද්‍රාවණයක් සකස් කරන්න.අතරමැදි සම්මත තනුකයක් ලෙස 110 µg/L (110 ppb) BDDE ද්‍රාවණයක් සකස් කිරීමට මෙම විසඳුම භාවිතා කරන්න.ඉන්පසුව, 75, 50, 25, 10 සහ 1 ppb හි අපේක්ෂිත සාන්ද්‍රණය ලබා ගැනීම සඳහා අතරමැදි තනුක කිහිප වතාවක් තනුක කිරීමෙන් සම්මත වක්‍රය සකස් කිරීමට අතරමැදි BDDE සම්මත තනුක (110 ppb) භාවිතා කරන්න.රූප සටහන 1 හි පෙන්වා ඇති පරිදි, BDDE සම්මත වක්‍රය 1.1 සිට 110 ppb දක්වා හොඳ රේඛීයතාවයක් ඇති බව සොයාගෙන ඇත (R2>0.99).සම්මත වක්රය ස්වාධීන අත්හදා බැලීම් හතරකදී නැවත නැවතත් සිදු විය.
රූප සටහන 1 BDDE සම්මත ක්‍රමාංකන වක්‍රය LC-MS විශ්ලේෂණය මගින් ලබා ගන්නා අතර, එහි හොඳ සහසම්බන්ධයක් නිරීක්ෂණය කෙරේ (R2>0.99).
කෙටි යෙදුම්: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ඊතර්;LC-MS, ද්‍රව වර්ණදේහ සහ ස්කන්ධ වර්ණාවලිමිතිය.
හරස් සම්බන්ධිත HA හි ඇති BDDE ප්‍රමිතීන් සහ මූලික විසඳුමේ BDDE ප්‍රමිතීන් හඳුනා ගැනීම සහ ප්‍රමාණනය කිරීම සඳහා, LC-MS විශ්ලේෂණය භාවිතා කරන ලදී.
වර්ණලේඛන වෙන්වීම LUNA 2.5 µm C18(2)-HST තීරුවක් (50×2.0 mm2; Phenomenex, Torrance, CA, USA) මත සාක්ෂාත් කර ගෙන විශ්ලේෂණය අතරතුර කාමර උෂ්ණත්වයේ (25°C) තබා ඇත.ජංගම අදියර 0.1% ෆෝමික් අම්ලය අඩංගු ඇසිටොනිට්‍රයිල් (ද්‍රාවක A) සහ ජලය (ද්‍රාවක B) වලින් සමන්විත වේ.ජංගම අදියර ශ්‍රේණිගත කිරීම මගින් ඉවත් කරනු ලැබේ.අනුක්‍රමණය පහත පරිදි වේ: මිනිත්තු 0, 2% A;මිනිත්තු 1, 2% A;මිනිත්තු 6, 98% A;මිනිත්තු 7, 98% A;මිනිත්තු 7.1, 2% A;මිනිත්තු 10 , 2% A. ධාවන කාලය විනාඩි 10 ක් වන අතර එන්නත් පරිමාව 20 µL වේ.BDDE හි රඳවා ගැනීමේ කාලය විනාඩි 3.48 ක් පමණ වේ (පරීක්ෂණ මත පදනම්ව විනාඩි 3.43 සිට 4.14 දක්වා පරාසයක පවතී).LC-MS විශ්ලේෂණය සඳහා ජංගම අදියර 0.25 mL/min ප්රවාහ අනුපාතයකින් පොම්ප කරන ලදී.
BDDE විශ්ලේෂණය සහ MS මගින් ප්‍රමාණනය කිරීම සඳහා, UPLC පද්ධතිය (Waters) API 3000 triple quadrupole ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂයක් (AB SCIEX) සමඟ ඒකාබද්ධ කර ඇති අතර විද්‍යුත් ඉසින අයනීකරණ ප්‍රභවයකින් සමන්විත වන අතර විශ්ලේෂණය ධනාත්මක අයන මාදිලියෙන් (ESI+) සිදු කෙරේ.
BDDE හි සිදු කරන ලද අයන ඛණ්ඩක විශ්ලේෂණයට අනුව, ඉහළම තීව්‍රතාවයකින් යුත් කැබැල්ල 129.1 Da ට අනුරූප කොටස ලෙස තීරණය කරන ලදී (රූපය 6).එබැවින්, ප්‍රමාණකරණය සඳහා බහු-අයන අධීක්ෂණ මාදිලියේ (MIM) BDDE හි ස්කන්ධ පරිවර්තනය (ස්කන්ධ-ආරෝපණ අනුපාතය [m/z]) 203.3/129.1 Da වේ.එය LC-MS විශ්ලේෂණය සඳහා සම්පූර්ණ ස්කෑන් (FS) මාදිලිය සහ නිෂ්පාදන අයන ස්කෑන් (PIS) මාදිලිය ද භාවිතා කරයි.
ක්‍රමයේ නිශ්චිතභාවය තහවුරු කිරීම සඳහා, හිස් නියැදියක් (ආරම්භක ජංගම අදියර) විශ්ලේෂණය කරන ලදී.203.3/129.1 Da ස්කන්ධ පරිවර්තනයක් සහිත හිස් සාම්පලයේ කිසිදු සංඥාවක් අනාවරණය නොවීය.අත්හදා බැලීමේ පුනරාවර්තන හැකියාව සම්බන්ධයෙන්, 55 ppb (ක්‍රමාංකන වක්‍රය මැද) සම්මත එන්නත් 10 ක් විශ්ලේෂණය කරන ලද අතර, එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස අවශේෂ සම්මත අපගමනය (RSD) <5% (දත්ත පෙන්වා නැත).
අවශේෂ BDDE අන්තර්ගතය ස්වාධීන අත්හදා බැලීම් හතරකට අනුරූප වන විවිධ ස්වයංක්‍රීය BDDE හරස්-සම්බන්ධිත HA හයිඩ්‍රොජෙල් අටකින් ප්‍රමාණ කරන ලදී."ද්‍රව්‍ය සහ ක්‍රම" කොටසේ විස්තර කර ඇති පරිදි, ප්‍රමාණනය BDDE සම්මත තනුකයේ ප්‍රතිගාමී වක්‍රයේ සාමාන්‍ය අගය මගින් ඇගයීමට ලක් කෙරේ, එය BDDE ස්කන්ධ සංක්‍රාන්තිය 203.3/129.1 Da, රඳවා තබා ගැනීමකින් අනාවරණය වූ අද්විතීය උච්චයට අනුරූප වේ. කාලය විනාඩි 3.43 සිට 4.14 දක්වා බලා සිටීම නොවේ.රූප සටහන 2 හි 10 ppb BDDE සමුද්දේශ ප්‍රමිතියේ උදාහරණ වර්ණදේහයක් පෙන්වයි.වගුව 1 විවිධ හයිඩ්‍රොජෙල් අටක අවශේෂ BDDE අන්තර්ගතය සාරාංශ කරයි.අගය පරාසය 1 සිට 2.46 ppb වේ.එබැවින්, නියැදියේ ඉතිරිව ඇති BDDE සාන්ද්‍රණය මිනිස් භාවිතය සඳහා පිළිගත හැකිය (<2 ppm).
රූපය 2 203.30/129.10 Da (ධන MRM මාදිලියේ) LC-MS විශ්ලේෂණයෙන් ලබාගත් 10 ppb BDDE සමුද්දේශ ප්‍රමිතිය (Sigma-Aldrich Co), MS (m/z) සංක්‍රාන්තිය Ion chromatogram.
කෙටි යෙදුම්: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ඊතර්;LC-MS, ද්රව වර්ණදේහ සහ ස්කන්ධ වර්ණාවලිමිතිය;MRM, බහු ප්රතික්රියා නිරීක්ෂණ;එම්එස්, ස්කන්ධය;m/z, ස්කන්ධ-ආරෝපණ අනුපාතය.
සටහන: සාම්පල 1-8 ස්වයංක්‍රීය BDDE හරස්-සම්බන්ධිත HA හයිඩ්‍රොජෙල් වේ.හයිඩ්‍රොජෙල් හි ඉතිරිව ඇති BDDE ප්‍රමාණය සහ BDDE රඳවා ගැනීමේ කාලයෙහි උපරිමය ද වාර්තා වේ.අවසාන වශයෙන්, විවිධ රඳවා ගැනීමේ වේලාවන් සහිත නව කඳු මුදුන්වල පැවැත්ම ද වාර්තා වේ.
කෙටි යෙදුම්: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ඊතර්;HA, හයුලූරොනික් අම්ලය;MRM, බහු ප්රතික්රියා නිරීක්ෂණ;tR, රඳවා ගැනීමේ කාලය;LC-MS, ද්රව වර්ණදේහ සහ ස්කන්ධ වර්ණාවලිමිතිය;RRT, සාපේක්ෂ රඳවා ගැනීමේ කාලය.
පුදුමයට කරුණක් නම්, LC-MS අයන වර්ණදේහයේ විශ්ලේෂණය පෙන්නුම් කළේ විශ්ලේෂණය කරන ලද සියලුම ස්වයංක්‍රීය හරස්-සම්බන්ධිත HA හයිඩ්‍රොජෙල් සාම්පල මත පදනම්ව, මිනිත්තු 2.73 සිට 3.29 දක්වා කෙටි රඳවා ගැනීමේ කාලයකදී අමතර උපරිමයක් ඇති බවයි.උදාහරණයක් ලෙස, රූප සටහන 3 හි හරස්-සම්බන්ධිත HA නියැදියක අයන වර්ණදේහ පෙන්වයි, එහිදී ආසන්න වශයෙන් මිනිත්තු 2.71 ක වෙනස් රඳවා ගැනීමේ වේලාවක අමතර උච්චයක් දිස්වේ.BDDE වෙතින් අලුතින් නිරීක්ෂණය කරන ලද උපරිමය සහ උච්චය අතර නිරීක්ෂණය කරන ලද සාපේක්ෂ රඳවා ගැනීමේ කාලය (RRT) 0.79 (වගුව 1) ලෙස සොයා ගන්නා ලදී.LC-MS විශ්ලේෂණයේදී භාවිතා කරන ලද C18 තීරුවේ අලුතින් නිරීක්ෂණය කරන ලද උච්චය අඩුවෙන් රඳවා ඇති බව අප දන්නා බැවින්, නව උච්චය BDDE ට වඩා ධ්‍රැවීය සංයෝගයකට අනුරූප විය හැකිය.
රූප සටහන 3 LC-MS (MRM ස්කන්ධ පරිවර්තනය 203.3/129.0 Da) මගින් ලබාගත් හරස් සම්බන්ධිත HA හයිඩ්‍රොජෙල් සාම්පලයේ අයන වර්ණදේහය.
කෙටි යෙදුම්: HA, hyaluronic අම්ලය;LC-MS, ද්රව වර්ණදේහ සහ ස්කන්ධ වර්ණාවලිමිතිය;MRM, බහු ප්රතික්රියා නිරීක්ෂණ;RRT, සාපේක්ෂ රඳවා ගැනීමේ කාලය;tR, රඳවා ගැනීමේ කාලය.
නිරීක්ෂණය කරන ලද නව කඳු මුදුන් මුලින් භාවිතා කරන ලද අමුද්‍රව්‍යවල ඇති දූෂක විය හැකි බව බැහැර කිරීම සඳහා, මෙම අමුද්‍රව්‍ය ද එම LC-MS විශ්ලේෂණ ක්‍රමය භාවිතා කර විශ්ලේෂණය කරන ලදී.විශ්ලේෂණය කරන ලද ආරම්භක ද්‍රව්‍ය අතරට ජලය, ජලයේ 2% NaHA, ජලයේ 1% NaOH සහ හරස් සම්බන්ධක ප්‍රතික්‍රියාවේදී භාවිතා කරන එකම සාන්ද්‍රණයෙන් BDDE ඇතුළත් වේ.භාවිතා කරන ලද ආරම්භක ද්‍රව්‍යයේ අයන වර්ණදේහය කිසිදු සංයෝගයක් හෝ උච්චයක් නොපෙන්වන අතර එහි රඳවා ගැනීමේ කාලය නිරීක්ෂණය කරන ලද නව උච්චයට අනුරූප වේ.ආරම්භක ද්‍රව්‍යයේ විශ්ලේෂණ ක්‍රියා පටිපාටියට බාධාවක් විය හැකි සංයෝග හෝ ද්‍රව්‍ය අඩංගු විය හැකි බව පමණක් නොව, වෙනත් රසායනාගාර නිෂ්පාදන සමඟ හරස් දූෂණය වීමේ සලකුණක් නොමැත යන අදහස මෙම කරුණ ඉවත දමයි.BDDE සහ නව මුදුන් වල LC-MS විශ්ලේෂණයෙන් පසු ලබාගත් සාන්ද්‍රණ අගයන් 2 වගුවේ (නියැදි 1-4) සහ රූප සටහන 4 හි අයන වර්ණදේහයේ දක්වා ඇත.
සටහන: නියැදි 1-4 ස්වයංක්‍රීය BDDE හරස් සම්බන්ධිත HA හයිඩ්‍රොජෙල් නිෂ්පාදනය කිරීමට භාවිතා කරන අමුද්‍රව්‍යවලට අනුරූප වේ.මෙම සාම්පල ස්වයංක්‍රීයකරණය කර නැත.
කෙටි යෙදුම්: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ඊතර්;HA, හයුලූරොනික් අම්ලය;LC-MS, ද්රව වර්ණදේහ සහ ස්කන්ධ වර්ණාවලිමිතිය;MRM, බහු ප්රතික්රියා නිරීක්ෂණ.
HA සහ BDDE හි හරස් සම්බන්ධක ප්‍රතික්‍රියාවෙහි භාවිතා කරන අමුද්‍රව්‍යවල නියැදියක LC-MS වර්ණදේහයට රූප සටහන 4 අනුරූප වේ.
සටහන: මේ සියල්ල මනිනු ලබන්නේ හරස් සම්බන්ධක ප්‍රතික්‍රියාව සිදු කිරීමට භාවිතා කරන එකම සාන්ද්‍රණය සහ අනුපාතයෙනි.වර්ණදේහ මගින් විශ්ලේෂණය කරන ලද අමුද්‍රව්‍ය සඳහා සංඛ්‍යා අනුරූප වන්නේ: (1) ජලය, (2) 2% HA ජලීය ද්‍රාවණය, (3) 1% NaOH ජලීය ද්‍රාවණය.LC-MS විශ්ලේෂණය 203.30/129.10 Da (ධන MRM මාදිලියේ) ස්කන්ධ පරිවර්තනය සඳහා සිදු කෙරේ.
කෙටි යෙදුම්: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ඊතර්;HA, හයුලූරොනික් අම්ලය;LC-MS, ද්රව වර්ණදේහ සහ ස්කන්ධ වර්ණාවලිමිතිය;MRM, බහු ප්රතික්රියා නිරීක්ෂණ.
නව කඳු මුදුන් ඇතිවීමට හේතු වූ තත්ත්වයන් අධ්‍යයනය කරන ලදී.හරස්-සම්බන්ධිත HA හයිඩ්‍රොජෙල් නිපදවීමට භාවිතා කරන ප්‍රතික්‍රියා තත්වයන් BDDE හරස් සම්බන්ධක කාරකයේ ප්‍රතික්‍රියාවට බලපාන ආකාරය අධ්‍යයනය කිරීම සඳහා, නව කඳු මුදුන් (හැකි අතුරු නිෂ්පාදන) සෑදීමට මග පාදයි.මෙම නිර්ණය වලදී, අපි ජලීය මාධ්‍යයක විවිධ සාන්ද්‍රණයන් NaOH (0%, 1%, 0.1%, සහ 0.01%) සමඟ ප්‍රතිකාර කරන ලද අවසාන BDDE හරස් ලින්කර් අධ්‍යයනය කර විශ්ලේෂණය කළෙමු.එකම කොන්දේසි අනුකරණය කිරීමට බැක්ටීරියා ක්‍රියා පටිපාටිය හරස් සම්බන්ධිත HA හයිඩ්‍රොජෙල් නිපදවීමට භාවිතා කරන ක්‍රමයට සමාන වේ."ද්රව්ය සහ ක්රම" කොටසේ විස්තර කර ඇති පරිදි, නියැදියේ ස්කන්ධ සංක්රමණය LC-MS විසින් 203.30/129.10 Da වෙත විශ්ලේෂණය කරන ලදී.BDDE සහ නව උච්චයේ සාන්ද්‍රණය ගණනය කරනු ලබන අතර, ප්‍රතිඵල 3 වගුවේ දක්වා ඇත. ද්‍රාවණයේ NaOH පැවතීම නොසලකා ස්වයංක්‍රීයව ක්ලේව් නොකළ සාම්පලවල නව උච්චයන් අනාවරණය නොවීය (නියැදි 1-4, වගුව 3)ස්වයංක්‍රීය සාම්පල සඳහා, නව උච්ච හඳුනාගනු ලබන්නේ ද්‍රාවණයේ NaOH පවතින විට පමණක් වන අතර, උච්චය සෑදීම ද්‍රාවණයේ NaOH සාන්ද්‍රණය මත රඳා පවතින බව පෙනේ (සාම්පල 5-8, වගුව 3) (RRT = 0.79).රූප සටහන 5 මගින් අයන වර්ණදේහයේ උදාහරණයක් පෙන්වයි, NAOH පවතින හෝ නොමැති ස්වයංක්‍රීය සාම්පල දෙකක් පෙන්වයි.
කෙටි යෙදුම්: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ඊතර්;LC-MS, ද්රව වර්ණදේහ සහ ස්කන්ධ වර්ණාවලිමිතිය;MRM, බහු ප්රතික්රියා නිරීක්ෂණ.
සටහන: ඉහළ වර්ණදේහය: නියැදිය 0.1% NaOH ජලීය ද්‍රාවණයකින් ප්‍රතිකාර කර ස්වයංක්‍රීයව (විනාඩි 20ක් සඳහා 120°C).පහළ වර්ණ සටහන: නියැදිය NaOH සමඟ ප්‍රතිකාර නොකළ නමුත් එම කොන්දේසි යටතේම ස්වයංක්‍රීයකරණය කර ඇත.203.30/129.10 Da හි ස්කන්ධ පරිවර්තනය (ධන MRM ආකාරයෙන්) LC-MS මගින් විශ්ලේෂණය කරන ලදී.
කෙටි යෙදුම්: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ඊතර්;LC-MS, ද්රව වර්ණදේහ සහ ස්කන්ධ වර්ණාවලිමිතිය;MRM, බහු ප්රතික්රියා නිරීක්ෂණ.
NaOH සමඟ හෝ රහිතව සියලුම ස්වයංක්‍රීය සාම්පලවල BDDE සාන්ද්‍රණය විශාල ලෙස අඩු වී ඇත (16.6 ගුණයක් දක්වා) (නියැදි 5-8, වගුව 2).BDDE සාන්ද්‍රණය අඩුවීම නිසා අධික උෂ්ණත්වවලදී ජලය 1,2-diol සංයෝගයක් සෑදීම සඳහා BDDE හි ඉපොක්සයිඩ් වළල්ල විවෘත කිරීමට පදනමක් (නියුක්ලියෝෆයිල්) ලෙස ක්‍රියා කළ හැකිය.මෙම සංයෝගයේ මොනොයිසොටොපික් ගුණය BDDE වලට වඩා වෙනස් වන අතර එම නිසා බලපෑමට ලක් නොවනු ඇත.LC-MS විසින් 203.30/129.10 Da ස්කන්ධ මාරුවක් අනාවරණය කර ගන්නා ලදී.
අවසාන වශයෙන්, මෙම අත්හදා බැලීම් මගින් පෙන්නුම් කරන්නේ නව උච්ච උත්පාදනය BDDE, NAOH සහ ස්වයංක්‍රීය ක්ලේවිං ක්‍රියාවලිය මත රඳා පවතින නමුත් HA සමඟ කිසිදු සම්බන්ධයක් නොමැති බවයි.
ආසන්න වශයෙන් මිනිත්තු 2.71 ක රඳවා ගැනීමේ වේලාවක සොයාගත් නව උච්චය පසුව LC-MS මගින් සංලක්ෂිත විය.මෙම කාර්යය සඳහා, BDDE (9.9 mg/mL) 1% NaOH ජලීය ද්‍රාවණයක සහ ස්වයංක්‍රීයකරණය කරන ලදී.වගුව 4 හි, නව උච්චයේ ලක්ෂණ දන්නා BDDE සමුද්දේශ උච්චය සමඟ සංසන්දනය කර ඇත (රැඳවුම් කාලය ආසන්න වශයෙන් විනාඩි 3.47).ශිඛර දෙකෙහි අයන ඛණ්ඩනය විශ්ලේෂණය මත පදනම්ව, මිනිත්තු 2.72 ක රඳවා ගැනීමේ කාලයක් සහිත උච්චය BDDE උච්චයට සමාන කොටස් පෙන්නුම් කරන නමුත් විවිධ තීව්‍රතාවයකින් යුක්ත බව නිගමනය කළ හැකිය (රූපය 6).මිනිත්තු 2.72 ක රඳවා ගැනීමේ කාලය (PIS) ට අනුරූප වන උපරිමය සඳහා, Da 147 ක ස්කන්ධයකින් ඛණ්ඩනය වීමෙන් පසුව වඩාත් තීව්‍ර උච්චයක් නිරීක්ෂණය විය.මෙම නිර්ණය සඳහා භාවිතා කරන ලද BDDE සාන්ද්‍රණයේදී (9.9 mg/mL), පාරජම්බුල වර්ණාවලියේ විවිධ අවශෝෂණ මාතයන් (UV, λ=200 nm) වර්ණදේහ වෙන් කිරීමෙන් පසුව ද නිරීක්ෂණය කරන ලදී (රූපය 7).මිනිත්තු 2.71 ක රඳවා ගැනීමේ කාලය සහිත උච්චය තවමත් 200 nm හි දෘශ්‍යමාන වන අතර BDDE උච්චය එම තත්ත්‍වයන් යටතේම වර්ණදේහයේ නිරීක්ෂණය කළ නොහැක.
වගුව 4 නව උච්චයේ මිනිත්තු 2.71 ක පමණ රඳවා ගැනීමේ කාලයකින් සහ BDDE උච්චයේ මිනිත්තු 3.47 ක රඳවා ගැනීමේ කාලයකින් සංලක්ෂිත ප්‍රතිඵල
සටහන: මෙම ප්‍රතිඵල ලබා ගැනීම සඳහා, LC-MS සහ HPLC විශ්ලේෂණ (MRM සහ PIS) මුදුන් දෙකෙහි සිදු කරන ලදී.HPLC විශ්ලේෂණය සඳහා, 200 nm තරංග ආයාමයක් සහිත UV හඳුනාගැනීම භාවිතා වේ.
කෙටි යෙදුම්: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ඊතර්;HPLC, ඉහළ කාර්ය සාධන ද්රව වර්ණදේහ;LC-MS, ද්රව වර්ණදේහ සහ ස්කන්ධ වර්ණාවලිමිතිය;MRM, බහු ප්රතික්රියා නිරීක්ෂණ;m/z, ස්කන්ධ-ආරෝපණ අනුපාතය;PIS, නිෂ්පාදන අයන ස්කෑන් කිරීම;පාරජම්බුල කිරණ, පාරජම්බුල කිරණ.
සටහන: ස්කන්ධ කොටස් LC-MS විශ්ලේෂණය (PIS) මගින් ලබා ගනී.Top chromatogram: BDDE සම්මත නියැදි කොටස්වල ස්කන්ධ වර්ණාවලිය.පහළ වර්ණදේහය: අනාවරණය කරගත් නව උච්චයේ ස්කන්ධ වර්ණාවලිය (BDDE මුදුනට සම්බන්ධ RRT 0.79 වේ).BDDE 1% NaOH ද්‍රාවණයකින් සකසන ලද අතර ස්වයංක්‍රීයකරණය කරන ලදී.
කෙටි යෙදුම්: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ඊතර්;LC-MS, ද්රව වර්ණදේහ සහ ස්කන්ධ වර්ණාවලිමිතිය;MRM, බහු ප්රතික්රියා නිරීක්ෂණ;PIS, නිෂ්පාදන අයන ස්කෑන්;RRT, සාපේක්ෂ රඳවා ගැනීමේ කාලය.
රූප සටහන 7 203.30 Da පූර්වගාමී අයනයේ අයන වර්ණදේහය, සහ (A) මිනිත්තු 2.71 ක රඳවා ගැනීමේ කාලය සහිත නව උච්චය සහ (B) BDDE යොමු සම්මත උච්චයේ UV හඳුනාගැනීම විනාඩි 3.46 200 nm ට.
නිපදවන ලද සියලුම හරස්-සම්බන්ධිත HA හයිඩ්‍රොජෙල් වල, LC-MS ප්‍රමාණකරණයෙන් පසු අවශේෂ BDDE සාන්ද්‍රණය <2 ppm බව නිරීක්ෂණය කරන ලදී, නමුත් විශ්ලේෂණයේ දී නව නොදන්නා උච්චයක් දිස් විය.මෙම නව උච්චය BDDE සම්මත නිෂ්පාදනයට නොගැලපේ.BDDE සම්මත නිෂ්පාදනය ද ධනාත්මක MRM මාදිලියේ එම තත්ත්ව පරිවර්තනය (MRM පරිවර්තනය 203.30/129.10 Da) විශ්ලේෂණයට භාජනය වී ඇත.සාමාන්‍යයෙන්, හයිඩ්‍රොජෙල් වල BDDE හඳුනාගැනීම සඳහා සිමා පරීක්ෂණ ලෙස ක්‍රොමැටෝග්‍රැෆි වැනි වෙනත් විශ්ලේෂණ ක්‍රම භාවිතා කරයි, නමුත් උපරිම හඳුනාගැනීමේ සීමාව (LOD) 2 ppm ට වඩා තරමක් අඩුය.අනෙක් අතට, මෙතෙක් NMR සහ MS භාවිතා කර ඇත්තේ හරස් සම්බන්ධිත HA නිෂ්පාදනවල සීනි ඒකක කොටස්වල හරස් සම්බන්ධ කිරීමේ සහ/හෝ HA වෙනස් කිරීමේ මට්ටම සංලක්ෂිත කිරීමටයි.මෙම ශිල්පීය ක්‍රමවල අරමුණ අප මෙම ලිපියේ විස්තර කර ඇති පරිදි (අපගේ LC-MS ක්‍රමයේ LOD = 10 ppb) එතරම් අඩු සාන්ද්‍රණයකින් අවශේෂ BDDE හඳුනාගැනීම් ප්‍රමාණ කිරීම කිසි විටෙක නොවේ.